پایان نامه کارشناسی ارشد زیست شناسی : تشخيص برخي از سرووارهاي سالمونلا انتريكا به كمك Multiplex PCR

متن کامل پایان نامه مقطع ارشد زیست شناسی

با عنوان :  تشخيص برخي از سرووارهاي سالمونلا انتريكا به كمك Multiplex PCR

در ادامه مطلب می توانید تکه هایی از ابتدای این پایان نامه را بخوانید

و در صورت نیاز به متن کامل آن می توانید از لینک پرداخت و دانلود آنی برای خرید این پایان نامه اقدام نمائید.

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی

گرایش میکروبیولوژی

عنوان:

تشخيص برخي از سرووارهاي سالمونلا انتريكا به كمك Multiplex PCR در موارد اسهالي ارجاعي به بيمارستان­هاي سبزوار

استاد راهنما:

دکتر علی اکبر جنت آبادی

استاد مشاور:

دکتررضا نظام زاده

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شود

تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………..2

فصل اول- مقدمه                                                                

   مقدمه وهدف………………………………………………………………………………………………………………..4

فصل دوم-مروری بر تحقیقات گذشته                                          

2-1- خصوصیات سالمونلا……………………………………………………………………………………………..8          

2-1-1- تاریخچه…………………………………………………………………………………………………………….8          

2-1-2- طبقه بندی………………………………………………………………………………………………………….9          

2-1-3- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک………………………………………………………10        

2-1-4- حساسیت به مواد شیمیایی………………………………………………………………………………….12        

2-1-5- ساختار پادگني سالمونلا……………………………………………………………………………………12        

2-1-6- روش های طبقه بندی……………………………………………………………………………………….14        

2-1-7- شرایط رشد سالمونلا………………………………………………………………………………………..15         

2-1-8- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………..17        

2-1-9- منشا سالمونلا…………………………………………………………………………………………………..20        

2-2- آلودگی در انسان………………………………………………………………………………………………….21        

2-2-1- میزان شیوع سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………22

2-2-2- علائم سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………………23

2-2-3- دوز آلوده کننده……………………………………………………………………………………………….25

2-2-4- پیشگیری………………………………………………………………………………………………………..25

2-3- سالمونلوز در حیوانات…………………………………………………………………………………………26

2-4- سالمونلوز در پرندگان………………………………………………………………………………………….27

2-4-1- آلودگی در طیور………………………………………………………………………………………………27

2-4-2- میزان شیوع…………………………………………………………………………………………………….28

2-5- روش های تشخیص سالمونلا………………………………………………………………………………..29

2-5-1- روش های کشت……………………………………………………………………………………………29

2-5-2- روش سرولوژیکی………………………………………………………………………………………….30

2-5-3- روش الایزا…………………………………………………………………………………………………. 30

2-5-4- روش آگلوتيناسيون به كمك لاتكس………………………………………………………………. 31

2-5-5-1-روشPCR……………………………………………………………………………………………….. 31        

2-5-5-2-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR………………………………………………………………. 31

2-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR………………………………………………………….33

2-5-5-4-   اجزای PCR…………………………………………………………………………………………..33

2-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا……………………………………………………………….34

فصل سوم:مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………….44          

3-1- وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………………………..45

3-2- مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………46

3-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی……………………………………………………………………………46

3-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط…………………………………………………………………46

3-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه……………………………………………………………..46

3-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی…………………………………………………………………………47

3-5- آزمون های بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………47

3-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی…………………………………………………………………..47

3-5-2- آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………… 48        

3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر………………………………………………………………………………….48

3-5-4- آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………..49

3-5-5- آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………49

3-5-6- آزمون حرکت………………………………………………………………………………………………..49

3-6- آزمون رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………………..49

   3-6-1- تهیه گسترش روی لام…………………………………………………………………………………..50

   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله…………………………………………………………………………50

3-6-3- مرحله شستشو……………………………………………………………………………………………..51

   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید…………………………………………………………………………51

   3-6-5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل………………………………………………………51

   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین…………………………………………………………………………………….51

   3-6-7- خشک کردن لام……………………………………………………………………………………………51

 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ………………………51

   3-7- استخراج DNA………………………………………………………………………………………………52                                                                    

3 -7-1-   مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………..52

3-8- آزمون PCR………………………………………………………………………………………………….. 52                                                                                              

3-8-1- مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………….52

3-8-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………53

3-9- الکتروفورز محصولاتPCR………………………………………………………………………………54                                                                  

3-9-1- مواد و وسائل لازم……………………………………………………………………………………….54      

3-9-2- تهیه بافر 1x………………………………………………………………………………………………..55

3-9-3- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………55

3-8-4- بارگذاری محصولات ……………………………….PCR…………………………55              

3-10- مشاهده باند های روی ژل………………………………………………………………………………56                                                      

3-10-1- مواد و وسایل لازم…………………………………………………………………………………….56

فصل چهارم :نتایج                                                                      

4-1 نتایج………………………………………………………………………………………………………………..58

4-2- کشت در محیط جامد انتخابی……………………………………………………………………………58

4-2-1- کشت در محیط XLD ………………………………………………………………………………..58                                                                            

4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار……………………………………………………………….59

4-3-آزمون گرم………………………………………………………………………………………………………..59

4-4-تست های بیو شیمیایی…………………………………………………………………………………………..60

4-4-1-آزمون .TSI……………………………………………………………………………………………………..60

4-4-2-آزمون اوره آز………………………………………………………………………………………………….60

4-4-3-آزمون ..VP…………………………………………………………………………………………………61

4-4-5-آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………….61

4-4-6-آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………… 61

4-4-7-آزمون حرکت…………………………………………………………………………………………………..62

4-5-استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………..63

4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار………………………………………………………………………63

4-6-آزمونPCR…………………………………………………………………………………………………………63

4 -7-نتایج آزمون کای دو……………………………………………………………………………………………67

فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            

5-1- بحث………………………………………………………………………………………………………………..69

5-2- نتیجه گیری نهایی………………………………………………………………………………………………77

5-3-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………….78

چكيده:

عفونت‌هاي سالمونلايي كه عفونت های غذايي ناميده مي‌شوند، ممكن است توسط هر يك از سرووارها ايجاد شود. معمولا باكتري عامل عفونت در ماده غذايي رشد مي‌كند تا به مقدار قابل توجهي برسد. به اين ترتيب احتمال عفونت افزايش يافته و موجب بروز بيماري در خانواده‌ها و گروه‌هاي بزرگ مي‌شوند. سالمونلا و سروتيپ‌هاي آن منبع مهم آلودگي‌هاي غذايي انسان و عامل پاتوژن بسيار قوي و بيماري‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باكتري گرم منفي، متحرك و باسيلي شكل است كه خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را داراست. امروزه بيش از 2450 سروتيپ سالمونلا شناسايي شده است كه برخي از اين سروتيپ‌ها عامل بيماري‌هايي از قبيل تب تيفوئيد و انتروكوليت در انسان مي‌باشند. در اين مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بيمارستان‌هاي شهرستان سبزوار جمع‌آوري گرديد و با رعايت كامل موارد بهداشتي به آزمایشگاه تخصصي دانشگاه آزاد اسلامي واحد سبزوار منتقل شدند. براي جداسازي اوليه از محيط كشت‌هاي بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گرديد. جهت تاييد تشخيص از تست‌هاي بيوشيميايي نظير TSI و اوره آگار و VP، اندول و سيمون سيترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باكتري سالمونلا با استفاده از روش كشت ميكروبي جدا شد. اين در حالي است كه با استفاده از روش مولكولي Multiplex PCR ، 21 مورد باكتري سالمونلا در نمونه‌ها رديابي گرديد. بنابراين مي‌توان گفت كه روش PCR نسبت به كشت ميكروبي از دقت بالاتري برخوردار است و همچنين روش‌هاي سنتي كشت ميكروبي اغلب زمان‌بر خسته‌كننده و پرهزينه است.

واژه‌هاي كليدي: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع

 مقدمه و هدف:

در طول دهه گذشته وقوع بيماري‌ها و عفونت های با منشا غذايي نه تنها در كشورهاي در حال توسعه و با فقر بهداشتي، بلكه در كشورهاي توسعه يافته و با استانداردهاي بالاي بهداشتي نيز رو به افزايش بوده و اين در حالي است كه وقوع عفونت‌ها و مسموميت‌هاي غذايي اغلب گزارش نشده باقي مي‌ماند و لذا تعيين آمار دقيق از ميزان ابتلا خصوصاً در كشورهاي درحال توسعه امكان‌پذير نمي‌باشد. غذا مي‌تواند به عنوان يك حامل، بسياري از ميكروارگانيسم‌هاي عامل عفونی یا غیر عفونی را در خود حمل کند که در بعضی از شرایط، رشد عامل عفونی را حمایت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و يا تنها نقش ناقل غيرفعال را ايفا مي‌نمايد كه در اين صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و يا تنها به وسيله‌ي غذا به انسان منتقل مي‌شود. بيماري‌هاي غذايي جزء بيماري‌هاي روده‌اي تقسيم‌بندي مي‌شوند كه از نظر اهميت در آمريكا بعد از بيماري‌هاي ريوي در مقام دوم قرار دارند. در يك بررسي در ايالات متحده گزارش شده كه بطور مستقيم هر آمريكايي حداقل هر سال يكبار به بيماري‌هاي روده‌اي با علامت اسهال مبتلا مي‌شوند. گفته مي‌شود كه اين مسئله به خاطر ناسالم بودن غذاي توليد شده در اين كشور نيست بلكه مردم با عمل‌آوري غلط و غيربهداشتي و يا از طريق انتقال عوامل عفوني خود غذا را ناسالم مي‌كنند (مهرور و همکاران،1385).

برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بيش از هزار ميليون مورد اسهال حاد در بين بچه‌هاي زير پنج سال در كشورهاي آمريكا، آسيا (به استثناي چين) و آمريكاي لاتين اتفاق مي‌افتد كه به مرگ بيش از پنج ميليون نفر منجر مي‌گردد. در كشورهاي صنعتي مشكل كمتر از اين‌هاست ولي به طور معنادار هنوز از اهميت خاصي برخوردار است. طبق گزارش‌هاي موجود تنها در يك همه‌گيري آن هم در كشوري مثل آمريكا بيش از 15000 نفر در اثر مصرف شيرآلوده به سالمونلاي مقاوم به آنتي‌بيوتيك مبتلا شدند. باكتري‌ها به عنوان مهم‌ترين عوامل در بروز بيماري‌هاي ناشي از مصرف غذا مي‌باشند(اردستانی و همکاران،1386). از جمله اين عوامل بيماري‌زا خانواده انتروباكترياسه است(تاجبخش،1386). خانواده انتروباكترياسه از تعداد زيادي باكتري گرم منفي تشكيل شده كه قرابت بسياري با هم دارند و در آب و خاك و مواد در حال فساد و گياهان و دستگاه گوارش انسان و حيوانات و حشرات يافت مي‌شوند. از آن جا كه جايگاه اصلي و طبيعي اين باكتري‌ها روده انسان و حيوانات مي‌باشد اصطلاحاً آنها را باسيل‌هاي روده‌اي يا انتريك مي‌نامند. باكتري‌هاي جنس سالمونلا گرم منفي، هوازي و بي‌هوازي اختياري، باسيلي شكل به اندازه‌ي 5-2 × 5/1 – 7/0 ميكرون هستند که خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را دارا مي‌باشند (تاجبخش،1376).

از لحاظ شرايط رشد اين ميكروارگانيسم‌ها باكتري‌هاي انعطاف‌پذيري بوده و به آساني با شرايط محيطي خود را هماهنگ مي‌كنند. اين جنس از ميكروارگانيسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌هاي پائين امكان بقاي آنها بيشتر است. اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا پاتوژن‌هاي بالقوه براي انسان و بسياري از حيوانات مي‌باشند. اين باكتري در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا کرده و بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی ، بيماري‌هايي با نشانه‌هاي گوناگون و عوارض متفاوت ايجاد مي‌كنند(زهرایی صالحی،1388). اين باكتري‌ها معمولاً از طريق مدفوع انسان یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردند. انسان و حیوانات در بیشتر موارد در اثر مصرف اين‌گونه مواد آلوده، باكتري را وارد دستگاه گوارش خود كرده و در نتيجه اين گردش دهاني – مدفوعي تداوم مي‌يابد(زهرایی صالحی،1388). باكتري سالمونلا انتريكا مهم‌ترين عامل در ابتلا به بيماري سالمونلوز در انسان مي‌باشد به طوري كه شيوع عفونت‌هاي سالمونلا انتريتيديس به خصوص در دهه‌ي اخير افزايش يافته است. فرد آلوده با سرووارهاي سالمونلا انتريكا اغلب مبتلا به تب، دردهاي ماهيچه‌‌هاي شكمي و اسهال مي‌باشد. شروع اين علائم از 12 ساعت تا يك هفته پس از مصرف غذاي آلوده ادامه دارد. اين بيماري اغلب 4 تا 7 روز به طول مي‌انجامد در بسياري از افراد بدون درمان با آنتي‌بيوتيك بهبود مي‌يابند. با اين حال، اسهال مي‌تواند شديد و گاهي اوقات منجر به بستري شدن افراد در بيمارستان گردد. بيماري در شيرخواران، كودكان و همچنين افراد مسن شدت داشته و نگران‌كننده مي‌باشد. در مواردي بيماري مي‌تواند به مرگ و مير در افراد حساس منجر شود(یوسفی مشعوف و همکاران ،1380) .

امروزه در آزمايشگاه‌هاي ميكروب‌شناي از سه روش رايج جهت شناسايي و تشخيص باكتري استفاده مي‌شود.

1- روش كشت سنتي و بيوشيميايي كه با تهيه نمونه و تهيه محيط كشت و تشخيص باكتري استفاده مي‌شود.

2- روش‌ها سرولوژيكي: برپايه تشخيص آنتي‌ژن‌هاي توليد شده توسط باكتر (آنتي‌ژن O و H) است.

3- روش‌هاي مولكولي: واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) يكي از رايج‌ترين روش‌هاي مولكولي است كه بر اساس حضور ژن خاص و يا به عبارت ديگر قطعه‌اي از DNA است در اين روش قطعه‌اي از ژن هدف تشكيل شده و وجود عامل پاتوژن اثبات مي‌گردد. چندين ژن هدف در سويه‌هاي سالمونلا وجود دارد(,…,( InvA, spvC, InvB, OmpC(کارلسون و همکاران، 2004).

ژن InvA كه براي تهاجم باكتري سالمونلا لازم است و بوسيله آن باكتري به قسمت‌هاي عمقي‌تر روده نفوذ مي‌كند براي جنس سالمونلا اختصاصي است(گورین و همکاران،2005).

در اين تحقيق كه در دانشگاه آزاد اسلامي واحد سبزوار انجام گرفت بر روي نمونه‌هاي كلينيكي (مدفوع) با استفاده از محيط‌هاي اختصاصي سالمونلا و سپس با روش مولكولي Multiplex PCR به شناسايي عوامل پاتوژني سالمونلا پرداختيم. هدف از این مطالعه ارزیابی تناسب ژن invA ،ompC و rfs به وسیله Multiplex PCR ،به عنوان روش اختصاصی برای تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا در نمونه های کلینیکی (مدفوع)بود . همچنین مقایسه روشPCR با روش های کشت سنتی و اختصاصی برای تشخیص سالمونلا بود.

2-1-خصوصيات سالمونلا :

2-1-1-تاريخچه :

بيماري هاي ناشي از سالمونلا در انسان و حيوانات از زمانهاي قديم وجود داشته ولي تشخيص تفريقي آن از ساير بيماري ها مشكل بوده است. در جلد اول و دوم كتاب ارزشمند تاريخ دامپزشكي و پزشكي ايران تأليف استاد گرانقدر جناب آقاي دكتر حسن تاج‌بخش به بيماري حصبه، تب مُطِبِقه و تب تيفوئيد اشاره شده است. در اوايل قرن 19 دو دانشمند فرانسوي به نامهاي لوئي[1] و كومل[2] نشانه هاي باليني و كالبدگشاي تب تيفوئيد را مورد بررسي قرار دادند(زهرایی صالحی،1388).

در سال 1837 گرهارد[3] در اپيدمي تيفوس در فيلادلفيا دو بيماري تيفوس و تيفوئيد را از هم متمايز ساخت. ادوارد جنر[4] در بين سالهاي 1849ـ1851 در بريتانيا از روي تجزيه و تحليل نشانه‌هاي بيماري‌هاي تب‌دار، تب تيفوئيد را تشخيص داد(زهرایی صالحی،1388).

ويليام باد[5] در طي 1856ـ1873 نشان داد كه تب تيفوئيد بيماري است عفوني و از طريق مدفوع انسان و حيوانات و آب آلوده انتقال مي‌يابد. در حال حاضر اين باكتري به عنوان سالمونلا تيفي شناخته مي‌شود. همچنين اين باكتري در سال 1885 توسط فيفر[6] از مدفوع، در سال 1886 توسط هوپ[7] از ادرار و در سال 1888 توسط ويلچور[8]و فون و ون‌فوتري[9] از كيسه صفرا، در سال 1907 بوسيله كانرادي[10] از فرد مبتلايي در دوره كمون بيماري جدا گرديد. در سال 1885 اسميت و سالمون جرمي را از خوك جدا كردند. بعدها نام اين جرم را سالمونلا كلراسويس گذاشتند(زاپور و دولی،2005). در سال 1888 جرم ديگري توسط گارتنر[11] از فردي كه در اثر گاستروانتريت ناشي از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسيلوس انتريتيديس ناميد كه بعداً سالمونلا انتريتيديس خوانده شد(آدامز و موس، 2000). لوفلر[12] در سال 1982 از بيماري مشابه تب تيفوئيد در موش جرمي را جدا كرد و آنرا باسيلوس تيفي موريوم نامگذاري كرد(داویس و واری، 1996). نوبل[13] در سال 1989 و وري[14] در سال 1908 جرم مشابهي را از خوكچه هندي جدا كردند كه بعداً سالمونلا تيفي موريوم ناميده شد. سالمونلاگاليناروم[15]اولين‌بار بوسيله كلين[16]در سال 1889 و سالمونلا پولوروم به وسيله رتگر[17]در سال 1900 مورد شناسايي قرار گرفت(هاوستاد ،1972). لينير[18] در سال 1900 خواص اجرام مربوط به پاراتيفوئيد B , A را مورد بررسي قرار داد و متوجه گرديد كه اين ارگانيسم‌ها شبيه باكتري‌هاي جدا شده توسط سالمون هستند به همين جهت به افتخار اولين كاشف اين باكتري‌ها پيشنهاد كرد كه آنها را سالمونلا بنامند. دانيل سالمون پاتولوژيست بود كه اولين بار سالمونلا را از روده خوك جدا كرد(تاجبخش،1382). در فاصله بين سالهاي 1925ـ1900 بزرگترين رويداد در كشف سرولوژيكي آنتي‌ژن‌هاي سوماتيك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسيله ليگنيرز[19] انجام شد(تاجبخش، 1385).در سال 1926 تركيبات پادگني سالمونلا طبقه‌بندي گرديد و جدولي به نام جدول كافمن ـ وايت ايجاد شد. در حال حاضر اين جدول داراي حدود 2500 سروتيپ است(کافمن، 1971) .

تعداد صفحه :101

قیمت : 14700 تومان

***

—-

:        ****       info@elmyar.net

جستجو در سایت : کلمه کلیدی خود را وارد نمایید :

 
 

مطالب مشابه را هم ببینید

 

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید