پایان نامه توليد آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 Neospora caninum و استفاده از آن در تدوين روش لاتكس آگلوتيناسيون LAT

دانلود متن کامل پایان نامه مقطع ارشد  دامپزشکي

گرایش : انگل شناسي

عنوان : توليد آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 Neospora caninum  و استفاده از آن در تدوين روش  لاتكس آگلوتيناسيون LAT

دانشگاه شیراز 

دانشکده دامپزشکي

 پايان نامه­ی‌ دکتري تخصصی در رشته‌ي دامپزشکي- انگل شناسي

 توليد آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 Neospora caninum  و استفاده از آن در تدوين روش  لاتكس آگلوتيناسيون LAT) ) و مقايسه ارزش تشخيصي آن با کيت تجاري الايزا

استادان راهنما

دکتر نسرين مقدر

دکتر ارسلان حسيني

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکيده

 نئوسپورا کانينوم، تک ياخته اي از شاخه آپي کمپلکسا، به عنوان عامل اصلي سقط در گاو شناخته شده است. آنتي ژن سطحي نئوسپورا کانينوم NcSAG1)) يک آنتي ژن ايمنودومينانت مهم براي تشخيص نئوسپوروزيس مي باشد. هدف از تحقيق حاضر توليد آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 و استفاده از آن در تدوين روش لاتكس آگلوتيناسيون LAT) ) و مقايسه ارزش تشخيصي آن با کيت تجاري الايزا است. ژن نوترکيب NcSAG1 در پلاسميد pET-28a کلون شد و پروتئين در E. coli BL21 بيان شد. ذرات لاتکس کربوکسيله با آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 پوشانده شد و درجه تطابق بين دو تست LAT و کيت تجاري الايزا(iscomELISA) بر روي 164 نمونه سرم گاو که از 32 گله حومه شيراز جمع آوري گرديد محاسبه شد. 22 (%13/4) و 23 (% 14 ) نمونه از سرم ها به ترتيب با تست LAT و الايزا حاوي آنتي بادي ضد نئوسپورا کانينوم بودند. در این روش تدوین شدحساسیت و اختصاصیت نسبی به ترتیب 81.8 و 96.4 درصد بود. 18 نمونه از 23 نمونه سرمي که با تست الايزا مثبت بودند با تست LAT نيز مثبت شدند و درجه تطابق قابل توجهي (κ = 0.77) بين نتايج دو تست به دست آمد. نتايج نشان داد که LAT براساس آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 تستي سريع، ساده و به نسبت کم هزينه است و براي تشخيص آنتي بادي هاي اختصاصي در آلودگي به نئوسپورا کانينوم تحت شرايط مزرعه مناسب به نظر مي رسد. البته به تحقيقات گسترده تري نياز است تا با تدوين روشهاي بهتري براي خالص سازي آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 بتوان واکنشهاي مثبت کاذب احتمالي را کاهش داد و در نتيجه درجه تطابق بين دو تست افزايش يابد.

 فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل اول: مقدمه…………………………………………………………………………………………….. 2

فصل دوم: کليات

1-2- تاريخچه……………………………………………………………………………………………………….. 7

2-2- طبقه بندي انگل……………………………………………………………………………………………………………. 8

3-2- سير تکاملي و ساختمان انگل ……………………………………………………………………………………… 8

4-2- آنتي ژن‌هاي انگل………………………………………………………………………………………………………… 11

1-4-2- آنتي ژنهاي سطحي (Surface Antigens)……………………………………………………… 13

2-4-2-  آنتي ژن هاي گرانول هاي متراكم…………………………………………………………………. 14

5- 2- تفريق نئوسپورا كانينوم از ساير گونه‌هاي انگلي………………………………………………………. 16

1-5- 2- هامونديا هيدورني (H. heydorni)………………………………………………………………….. 16

2-5- 2-  نئوسپورا هوگشي (N. hughesi)…………………………………………………………………… 17

3-5- 2–توكسوپلاسما گندئي……………………………………………………………………………………….. 17

6- 2- انتقال ……………………………………………………………………………………………………. 18

1-6- 2- انتقال عمودي…………………………………………………………………………………………………… 18

2-6- 2-انتقال افقي…………………………………………………………………………………………………………. 19

3-6- 2- انتقال از راه شير………………………………………………………………………………………………. 20

4-6- 2- انتقال از راه جفتگيري…………………………………………………………………………………….. 20

7- 2- نشانه هاي باليني……………………………………………………………………………………………………….. 21

1- 7- 2- گاو ………………………………………………………………………………………………………………….. 21

2- 7- 2- گوسفند…………………………………………………………………………………………………………… 22

3- 7- 2- اسب………………………………………………………………………………………………………………… 23

4-7- 2- بز……………………………………………………………………………………………………………………….. 23

عنوان                                                                                                                      صفحه

5-7- 2- سگ………………………………………………………………………………………………………………….. 23

6- 7- 2- گربه…………………………………………………………………………………………………………………. 24

7- 7- 2- انسان……………………………………………………………………………………………………………….. 24

8- 2- بيماريزايي………………………………………………………………………………………………………….. 25

1- 8- 2- مکانيسم سقط جنين ……………………………………………………………………………………. 26

2-8- 2-  آسيب هاي وارده به جفت  ………………………………………………………………………….. 27

3- 8- 2- آسيب هاي وارده به جنين……………………………………………………………………………. 27

9-2 – يافته‌هاي كالبدگشايي………………………………………………………………………………………………… 31

10-2-خسارات اقتصادي نئوسپوروزيس در گاو………………………………………………………………….. 31

11-2- عوامل مستعد كننده………………………………………………………………………………………………… 33

1-11-2-  حضور سگ ها……………………………………………………………………………………………….. 33

2-11-2-  ساير گوشتخواران………………………………………………………………………………………….. 33

3-11-2-  ميزبان‌هاي واسط به غير از گاو……………………………………………………………………. 33

4- 11-2- چراگاه، علوفه و آب شرب……………………………………………………………………………. 34

5-11-2- سن گله…………………………………………………………………………………………………………… 34

6-11-2- خوردن شير يا آغوز………………………………………………………………………………………… 34

7- 11-2- سرکوب ايمني ……………………………………………………………………………………………… 34

8- 11-2- تراكم گله و ابعاد مزرعه……………………………………………………………………………….. 35

9-11-2- آب و هوا…………………………………………………………………………………………………………. 35

10- 11-2- تراكم جمعيت انساني………………………………………………………………………………… 35

11-11-2- فصل و نژاد……………………………………………………………………………………………………. 35

12-11-2- پرورش………………………………………………………………………………………………………….. 35

12-2- ايمني…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

13-2- تشخيص…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

1- 13-2- روش‌هاي سرولوژيك…………………………………………………………………………………….. 38

1- 1- 13-2- روش ايمونو فلورسنت آنتي بادي غير مستقيم   (IFAT)……………. 40

2- 1- 13-2- روش آگلوتيناسيون مستقيم  (DAT) …………………………………………… 41

3- 1- 13-2- روش الايزا ……………………………………………………………………………………….. 42

4-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتيناسيون (LAT)…………………………………………………. 42

2- 13-2 – روش هاي تشخيص بافتي………………………………………………………………………….. 46

عنوان                                                                                                                      صفحه

1-2-13-2 –  هيستوپاتولوژي…………………………………………………………………………………… 46

2-2-13-2 –  هيستوشيمي……………………………………………………………………………………… 47

3-2- 13-2 – ايمنوهيستوشيمي……………………………………………………………………………. 47

3-13-2 –  تكنيك‌هاي مولكولي………………………………………………………………………………. 48

4- 13-2 – استفاده از  مدل هاي حيواني……………………………………………………………….. 48

5-13-2 –  روش كشت سلول………………………………………………………………………………….. 49

6-13-2 – تشخيص تفريقي………………………………………………………………………………………. 50

14-2 – درمان……………………………………………………………………………………………………………………….. 50

15-2 – پيشگيري و کنترل………………………………………………………………………………. 51

16-2 – پروتئين هاي نوترکيب و اهميت آنها………………………………………………………………………. 52

1-16-2 – سيستم هاي بيان ژن براي توليد پروتئين هاي نو ترکيب…………………………… 53

2-1-16-2 – سيستم هاي باکتريايي……………………………………………………………………………… 54

3-1-16-2- سيستمpET………………………………………………………………………………………………… 54

4-1-16-2 –  سيستم مخمري و قارچي ……………………………………………………………………… 54

5-1-16-2 – حشرات …………………………………………………………………………………………………….. 55

6-1-16-2  – سلول پستانداران …………………………………………………………………………………….. 55

فصل سوم: مواد و روش کار

1-3- طراحي پرايمرها…………………………………………………………………………………………………………… 58

2- 3- تهيه تاكي‌زوئيت نئوسپورا کانينوم……………………………………………………………………………. 58

3- 3- استخراج DNA از تاكي‌زوئيتهاي نئوسپورا کانينوم خالص شده……………………………. 59

۴- ۳- تکثير قسمتي از ژن NcSAG1 با روش PCR………………………………………………………… 60

5- ۳- خالص سازي باند مورد نظر از ژل آگاروز ………………………………………………………………… 61

6- ۳- اتصال Ligation) ) محصول PCR در پلاسميد pTZ57R …………………………………….. 62

7-3- تهيه ي سلول هاي پذيرا Competent cells)) از باکتري  E.coli GM2163 ……….. 62

٨-٣- وارد کردن پلاسميد به درون سلول باکتري ( (Transformation……………………………. 63

9-3- تأييد وجود پلاسميد حاوي قطعه ي ژن مورد نظر درون کولوني باکتري …………….. 63

۱۰- ۳- تعيين توالي پلاسميدهاي بدست آمده (Sequencing)………………………………………. 64

۱۱- ۳- برش قطعات حاوي NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a………………………………………… 66

۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a

 با آنزيم هاي NcoІ  و ІІІ Hind…………………………………………………………………………………… 67

عنوان                                                                                                                      صفحه

12- ۳- اتصال قطعات برش خورده ي NcSAG1 و پلاسميد  pET-28a(Ligation)…….. 67

 -۱۳ ۳- تأئيد وجود قطعه هدف NcSAG1)) درون پلاسميد  pET-28a………………………. 67

-۱۴ ۳- انتقال وكتورحاوي ژن موردنظر به داخل باكتري E.coli BL21 …………………………. 68

-۱۵ ۳- بررسي چند كولوني رشد كرده براي ارزيابي وجود ژن كلون شده……………………… 68

-۱۶ ۳- جداسازي پلاسميد SAG1-pET28 ……………………………………………………………………… 69

-۱۷ ۳- برش پلاسميد با آنزيمهاي NcoІ و HindІІІ  و الكتروفورز محصول

 براي اطمينان از وجود قطعه مورد نظر در پلاسميد  ……………………………………………………….. 69

-۱۸ ۳- انتخاب يك يا دو كلون براي توالي يابي (براي حصول اطمينان

از توالي درست ژن)…………………………………………………………………………………………………. 69

-۱۹ ۳- پس از حصول اطمينان از توالي ژن، كلون مورد نظر براي بيان ژن

مورد استفاده قرار مي گيرد…………………………………………………………………………………….. 69

۲۰-۳- خالص سازي (Purification) پروتئين هاي توليدشده به فرم گنجيدگي هاي

 درون سلولي(Inclusion body) تحت شرايط دناتوره کننده…………………………………………….. 70

۲۱-۳- حل کردن (Solubilization)و بازتاخوردگي ( Refolding) پروتئين هاي

توليدشده به فرم گنجيدگي هاي درون سلولي (Inclusion body)…………………………………… 71

۲۲- ۳- اندازه گيري غلظت پروتئين نوترکيب  NcSAG1به روش لوري………………………… 73

۲۳-۳- ارزيابي پروتئين نوتركيب خالص شده و بازتاخورده با استفاده از

SDS-PAGE  و وسترن بلاتينگ(Western Blotting)……………………………………………………… 74

۲۴- ۳- آزمايش وسترن بلاتينگ پروتئين ها……………………………………………………………………… 75

1-24- ۳-  بلاتينگ ……………………………………………………………………………………………………….. 75

2-24-3- مسدود سازي سطح کاغذ (Blocking)………………………………………………………… 75

3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا……………………………………………………………………. 76

4-24- ۳- اضافه کردن آنتي بادي کنژوگه……………………………………………………………………. 76

5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا………………………………………………………………………… 76

۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتكس با آنتي ژن نوتركيب NcSAG1……………………. 77

۲۶- ۳- جمع آوري نمونه هاي سرم……………………………………………………………………………………. 78

۲۷-۳- انجام تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT) )…………………………………………………………….. 78

۲۸-۳- انجام تست الايزا……………………………………………………………………………………………………….. 79

۲۹-۳- مقايسه ارزش تشخيصي تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT) )

 بر اساس آنتي ژن نوترکيب NcSAG1 با تست الايزا ………………………………………………………. 79

عنوان                                                                                                                      صفحه

فصل چهارم: نتايج

۱-۴- تکثير قسمتي از ژن NcSAG1 با روش PCR…………………………………………………………. 81

۲-۴- کلون کردن ژن NcSAG1 در پلاسميد pTZ57R/T………………………………………………. 82

۳-۴- استخراج پلاسميد از کلون 2163 E.coli GM حاوي قطعه ژني مورد نظر

در پلاسميد pTZ57R/T………………………………………………………………………………………………………… 83

۴-۴- برش پلاسميد حاوي قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  (کلون 2821)

با آنزيم ІІІ Hind …………………………………………………………………………………………………………………. 84

۵-۴- برش قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  بريده شده با آنزيم ІІІ Hind، بوسيله

 آنزيم NcoІ……………………………………………………………………………………………………………………………. 85

۶-۴- خالص سازي قطعه ژني و پلاسميدpET-28a  بريده شده با آنزيم هاي

 ІІІ Hind و NcoІ…………………………………………………………………………………………………………………. 86

۷-۴- کلون کردن قطعه ژني NcSAG1 بريده شده در پلاسميد pET-28a

 بريده شده با همان آنزيم ها………………………………………………………………………………………………… 87

۸-۴- نتايج بيان پروتئين نوتركيب………………………………………………………………………………………. 88

۹-۴- نتايج خالص سازي پروتئين نوترکيب توليدشده به فرم

 گنجيدگي هاي درون سلولي……………………………………………………………………………………………….. 91

۱۰-۴- نتايج اندازه گيري غلظت پروتئين نوترکيب NcSAG1 به روش لوري……………….. 93

۱۱-۴- نتايج حاصل از وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب خالص شده

 تحت شرايط دناتوره کننده…………………………………………………………………………………………………… 94

۱۲-۴- نتايج حاصل از الکتروفورز و وسترن بلاتينگ پروتئين نوترکيب بازتاخورده………… 95

۱۳-۴- نتايج حاصل از تست لاتكس آگلوتيناسيون……………………………………………………………. 95

فصل پنجم: بحث

پيشنهادات………………………………………………………………………………………………………. 103

فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………….. 104

مقدمه

  نئوسپورا کانينوم تك ياخته اجباري داخل سلولي از شاخه آپي کمپلکسا ، اولين بار توسط برکاس و همكارانش (۱٩۸۴) توصيف شد. دوبي و همكاران (۱٩۸۸) اين تک ياخته را براي اولين بار از سگ ها جدا و نامگذاري كردند (Dubey et al. 1988a,b) سپس مشخص شد كه ميزبان نهائي نئوسپورا کانينوم، سگ است (Holmdahl and Mattsson 1996; Lindsay et al. 1995  Basso et al. 2001;).

نئوسپورورزيس از علل اصلي سقط جنين گاو است، از اين رو با سقط ‌، مرده زائي، تولدگوساله ضعيف يا همراه با عفونت دائمي و كاهش توليد شير ضررهاي اقتصادي قابل توجهي ايجاد مي كند. انتشار عفونت در گاو با انتقال تاكي زوئيت از مادر به جنين و يا با خوردن آب و غذائي آلوده به اووسيست انگل صورت مي گيرد 1999, Trees et al. 1999; Romero et al. 2004) Dubey).

مطالعات انجام شده در برخي كشورها حاكي از اين است كه ۴۲-۱۳ درصد جنين هاي سقط شده در گاوها به اين انگل آلوده هستند (Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006 ). نئوسپورا کانينوم علاوه بر گاو ، ساير گونه هاي اهلي چون اسب، گوسفند، بز، شتر، سگ، گربه و سگ سانان وحشي را آلوده مي كند (Dubey 2003; Gondinm 2006 ).

نئوسپوروزيس انتشار جهاني داشته و از بسياري از كشورهاي جهان گزارش شده است، ايران نيز از اين قائده مستثني نيست. در بررسي آلودگي نئوسپورا کانينوم در گاوهاي شيري سقط كرده، رزمي و همكاران (۲۰۰۶) اولين مورد سقط جنين گاوي را در مشهد گزارش كردند و ۱۸/۱۵درصد نمونه هاي سرمي گاوها در تست  IFAمثبت بودند

(et al. 2007; Sadrebazzaz et al. 2004  Razmi).

با توجه به گزارشاتي مبني بر وجود آلودگي در گاوهاي كشور و خسارات اقتصادي حاصله بر صنعت گاوداري، طراحي و ارزيابي تستهاي تشخيصي حساس و اختصاصي كه توانايي تشخيص حيوانات آلوده را به منظور كنترل نئوسپورا کانينوم در سطح گله داشته باشند ضروري به نظر مي رسد.

از زمان شناسايي نئوسپورا کانينوم تاكنون روشهاي تشخيصي زيادي براي شناسايي آلودگي دامها به اين انگل ابداع شده است. از اين ميان مي توان به روشهاي هيستوپاتولوژي، ايمونوهيستوشيمي، سرولوژي، مولكولي، كشت سلولي و استفاده از حيوانات آزمايشگاهي اشاره نمو د

(2003 Dubey and Schares 2006 ; Dubey and Lindsay 1993; Dubey et al. 2006; Dubey )

تشخيص قطعي بر اساس آزمايش ايمونوهيستوشيمي بافتهاي آلوده است. اين روش معمولاﹰ براي تأييد ساير روشها و نيز براي تفکيک نئوسپورا کانينوم از توکسوپلاسما گندئي استفاده شده اما روشي وقت گير بوده و تفسير نتايج آن مشکل است

 (Dubey and Lindsay 1993; Jones 1996; Romand et al. 1998; Dubey and ;Schares 2006; Dubey 2003).

تشخيص آلودگي عمدتا با روشهاي سرولوژيکي، به عنوان ابزار مهمي براي بررسي هاي کلينيکي و اپيدميولوژيکي، انجام مي شود (et al. 2007 Silva).

آزمايشات سرولوژيك داراي اين مزيت هستند که قبل از مرگ دام قابل انجام بوده و اطلاعات کافي در مورد مرحله آلودگي فراهم مي سازند (Dubey and Schares 2006). از آنجايي که تنها نشانه در معرض قرار گرفتن با نئوسپورا کانينوم، حضور آنتي بادي هاي اختصاصي در سرم گاو است، روشهاي مختلف سرولوژيک براي تشخيص آنتي بادي به کار گرفته شده که شامل  IFAT، انواع الايزا وDAT هستند (et al. 1997 Williams  Romand et al. 1998;  Packham et al. 1998; Paré et al. 1995a;  Lally et al. 1996;  Conrad et al. 1993a;   Björkman and Lunden 1998; ). در اين روشها از تاکي زوئيت کامل يا آنتي ژن هاي مشتق شده از تاکي زوئيت استفاده مي شود که به علت واکنش متقاطع با ساير انگلهاي مربوطه مانند توکسوپلاسما گندئي باعث واکنش مثبت کاذب مي شود

(et al. 1993b; Dubey and Lindsay 1993 Conrad et al. 2003; ; 1999 Chahan Bjorkman and Uggla ). همچنين به علت نياز اين آزمايشات به استفاده از مقادير زياد آنتي ژنهاي مشتق شده از کشت سلولي، اغلب تهيه آنتي ژن و استاندارد کردن آن مشکل است و به دليل تفاوت در ميزان بقاياي سلول ميزبان بر اختصاصيت و تکرارپذيري نتايج تست تاثير مي گذارد (Lally et al. 1996;  Jiang et al. 2008;  al. 1996;   et Baszler). بنابراين ضروري است که تست تشخيصي مطمئن، حساس و اختصاصي با استفاده از آنتي ژن هاي اختصاصي نئوسپورا کانينوم طراحي شود.

آنتي ژن هاي نوترکيب درمقايسه با آنتي ژن هاي کامل، مزاياي بيشتري دارند زيرا اولا به آساني درحجم زياد تهيه مي شوند و ثانيا به راحتي براي آزمايشات تشخيصي استاندارد مي شوند. بنابراين با به كارگيري اين آنتي ژن ها، نيازي به آنتي ژن هاي مشتق شده از کشت سلولي نيست (et al. 2003; Louie et al. 1997  Chahan).

تاکنون چندين آنتي ژن نئوسپورا کانينوم شناسايي شده اند که اغلب آنها شامل
پروتئين هايي هستند که روي سطح مراحل مهاجم انگل ظاهر مي شوند مانند  NcSAG1و  NcSRS2که از آنتي ژن هاي سطحي ايمونودومينانت اصلي هستند
(immunodominant surface antigens  major). علاوه بر اين ، آنتي ژن هايي نيز هستند که بطور موقتي روي سطح تاکي زوئيت هاي انگل ظاهر مي شوند مانند محتويات ميکرونم، راپتري و گرانولهاي متراکم. اين ها ارگانل هاي ترشحي در ناحيه قدامي مراحل مهاجم انگل هستند و در واکنشهاي فيزيکي مستقيم بين انگل و سلول ميزبان نقش دارند
( Soldati et al. 2001; Sonda et al. 2000et al. 1998; Nishikawa et al. 2001a;b;  Liddell Lally et al. 1997;  Boothroyd 2000; Dubremetz et al. 1998; Hemphill et 1997 Black and ).  

اگرچه NcSAG1 و  NcSRS2 بطور واضح با همتاهاي خود در توکسوپلاسما گندئي (TgSAG1 و TgSRS2) هومولوگ هستند اما ميزان تشابه توالي به اندازه اي نيست که باعث بروز واکنش متقاطع شود، از اين رو به عنوان مارکرهاي تشخيصي عالي براي تمايز موثر بين نئوسپورا کانينوم و توکسوپلاسما گندئي قابل استفاده هستند (Howe et al. 1998). همچنين پاسخهاي ايمني القاء شده توسط اين آنتي ژن هاي سطحي، آنها را به مارکرهاي ايده آل براي تشخيص سرولوژيکي آلودگي به نئوسپورا کانينوم و تهيه واکسن تبديل كرده است

Chahan et al. 2003; Gaturaga et al. 2005; Howe et al. 1998; Liu et al. 2007; Pinitkiatisakul et al. 2005 ) Ahn et al. 2003; ).

تست الايزا با استفاده از آنتي ژن هاي tNcSRS2 -GST و GST-NcSAG1t براي تشخيص نئوسپورا کانينوم طراحي و مورد استفاده قرار گرفته است و نتايج نشان مي دهد که اين تست، حساسيت و اختصاصيت بالايي دارد و واکنش متقاطعي با سرم مثبت  توکسوپلاسما گندئي ندارد Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; Hemphill et al. 1997; l Gaturaga et al. 2005;  Ahn et al. 2003; ).

اكثر تستهاي تشخيصي به صورت كيت هاي تجاري وارداتي، پرهزينه و وقت گيرهستند و به مواد و ابزارخاصي نيز نياز دارند که آن ها را براي کاربرد فيلدي و کلينيکي نامناسب مي سازند (et al. 2005  Chahan et al. 2003; Liao )، از اين رو طراحي و ارزيابي تست تشخيصي با حساسيت و اختصاصيت بالا كه به ابزار اختصاصي پيشرفته نياز نداشته باشد و در عين حال سريع و آسان انجام شود ضروري است.

 تست لاتکس آگلوتيناسيون LAT)) يکي از راحت ترين تستهاي تشخيصي است و در حال حاضر به عنوان يک تست تجاري در دسترس براي تشخيص توکسوپلاسما گندئي استفاده مي شود ( et al. 2004  Huang). در تحقيقي از تست لاتکس آگلوتيناسيون LAT)) با  آنتي ژن نوترکيب TgMIC3 براي تشخيص سرولوژيکي توکسوپلاسما گندئي استفاده شده که به علت اختصاصيت بالا ، کاربرد سريع و ساده،کم هزينه بودن و مناسب  براي استاندارد شدن، روش تشخيصي مناسبي گزارش شده است (Jiang et al. 2008). تاکنون از اين تست براي تشخيص نئوسپورا کانينوم استفاده نشده ولي از آنجايي که TgMIC3 هومولوگ NcMIC3 است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانينوم واکنش متقاطع مي دهد ) Jiang et al. 2008)، در تحقيق حاضر از NcSAG1 نوترکيب به عنوان آنتي ژن براي تشخيص آنتي بادي ضد نئوسپورا کانينوم در گاو استفاده شد (2005 et al.  Chahan et al. 2003; Liao).

هدف از اين تحقيق طراحي و استاندارد کردن تست لاتكس آگلوتيناسيون LAT)) بر اساس آنتي ژن نوترکيب   NcSAG1 براي تشخيص سرولوژيکي نئوسپورا کانينوم و مقايسه ي ارزش تشخيصي اين تست با کيت تجاري الايزا است.

کليات

1-2- تاريخچه

 نئوسپورا کانينوم (Neospora caninum)  تک ياخته داخل سلولي اجباري از شاخه آپي کمپلکسا (Apicomplexa) و بسيار شبيه توکسوپلاسما گندئي (Toxoplasma gondii) است. در ابتدا در سگ هاي نروژي داراي علائم عصبي مانند آنسفاليت و فلجي اندام هاي حركتي انگلي شبيه به توكسوپلاسما گندئي گزارش شد (Bjerkas et al. 1984). سپس انگل در سال 1987 در گوساله هاي مبتلا به ميلوآنسفاليت مشاهده گرديد ( Anderson et al. 2000).

در يك مطالعه گذشته نگر مقاطع آسيب شناسي، نشانه هاي باليني و اطلاعات آزمايشگاهي ثبت شده از 23 سگ نروژي كه در آنها يك بيماري مانند توكسوپلاسموزيس تشخيص داده شده بود را مورد بررسي و با ميكروسكوپ نوري و الكتروني مورد مطالعه قرار دادند. در 13 مورد عامل بيماري توكسوپلاسما گندئي تشخيص داده شد، اما در 10 مورد ديگر از سگ ها يك جنس جديد به نام نئوسپورا و گونه اي به نام نئوسپورا كانينوم كه از نظر ساختماني و آنتي ژني متفاوت از توكسوپلاسما گندئي بود، تشخيص داده شد. به اين دليل اين انگل نئوسپورا نام گرفت كه از لحاظ سير تكاملي و ريخت شناسي مشابه با ساير اعضاي دسته اسپوروزوآ (Sporozoea) بود و چون براي اولين بار تشخيص داده مي شد انگل هاگ دار جديد يا نئوسپورا نام گرفت (2003b; Dubey et al. 1988 Dubey).

تا مدت ها سير تكاملي اين انگل كاملاً روشن نبود و ميزبان نهايي آن شناسايي نشده بود و تنها حدس زده مي شد كه به دليل شباهت هايي كه با خانواده ساركوسيستيده (Sarcocystidae) دارد بايد ميزبان نهايي آن يك گوشتخوار باشد. محققين تعداد زيادي از حيوانات و پرندگان را با مرحله كيستي انگل به طور تجربي آلوده كردند، اما نتوانستند اووسيست هاي انگل را به دست بياورند و همچنان ميزبان نهايي ناشناخته بود تا در يك بررسي اووسيست هاي انگل از دو قلاده سگ كه به طور طبيعي آلوده شده بودند، جدا شد و سگ به عنوان ميزبان نهايي انگل معرفي شد. مدتي بعد نيز اووسيست هاي اين انگل را از مدفوع چند قلاده كايوت جدا كردند و كايوت نيز به عنوان ميزبان نهايي انگل مطرح شد
 (Dubey 1992; Haddad et al. 2005 ).

از سال 1984 تا كنون شاهد پيشرفت هاي فراواني در زمينه يافته هاي جديد نئوسپورا بوده ايم، به طوري كه تا كنون مقالات زيادي در زمينه هاي مختلف نئوسپوروزيس از نقاط مختلف جهان منتشر شده است. در ايران نيز اولين بار سقط ناشي از نئوسپورا كانينوم در مشهد توسط رزمي و همكاران (2007) گزارش شد (Razmi et al. 2007 Dubey1999 b; ).

2-2– طبقه بندي انگل

تک ياخته نئوسپورا کانينوم در شاخه آپي کمپلکسا، رده اسپوروزوا، راسته اوکوکسيديدا (Eucoccidiidae) ، خانواده سارکوسيستيده، تحت خانواده توکسوپلاسماتينه (Toxoplasmatinae) و جنس نئوسپورا قرار دارد (1999 Hemphill).

3-2- سير تکاملي و ساختمان انگل

 نئوسپورا کانينوم انگل دو ميزبانه اجباري است (شكل 1-2). سگ و کايوت تنها ميزبان هاي نهايي شناخته شده براي نئوسپورا کانينوم هستند. سگ ها مي توانند هم ميزبان واسط و هم ميزبان نهايي انگل باشند. سير تكاملي انگل به سه مرحله تاکي زوئيت، برادي زوئيت و اووسيست تقسيم مي شود (et al. 2006 Dubey 2003b; Dubey  ).

اووسيست‌هاي انگل به همراه مدفوع ميزبان نهايي به بيرون منتشر و در محيط تحت شرايط مناسب (اكسيژن، رطوبت و درجه حرارت) در عرض سه روز هاگ دار مي‌شوند. داخل هر اووسيست، دو اسپوروسيست و داخل هر اسپوروسيست، چهار اسپوروزوئيت تشكيل مي شود. ابعاد اووسيست‌هاي هاگ دار حدود 7/11×3/11 ميكرون و اسپوروزوئيت‌ها 5/6×2 ميكرون است. اين اووسيست‌ها شبيه به اووسيست‌هاي توكسوپلاسما گندئي و هامونديا هاموندي (Hammondia hammondi) در مدفوع گربه و هامونديا هيدورني (Hammondia heydorni) در مدفوع سگ هستند كه جهت تفريق آنها از يكديگر استفاده از روش‌هاي ژنتيكي الزامي است (Dubey and Schares 2006 Dubey 2003b;  ).

اووسيست‌هاي هاگ دار انگل همراه با آب و مواد غذايي توسط ميزبان‌هاي واسط خورده مي‌شوند. اووسيست‌ها در روده، پاره و اسپوروزوئيت‌ها آزاد شده و پس از ورود به سلول هاي پوششي روده به تاكي زوئيت تبديل مي‌شوند. تاكي زوئيت‌هاي هلالي شكل به ابعاد 6×2 ميكرون هستند و به سرعت از طريق آندوديوژني تكثير مي يابند. تاكي زوئيت‌ها، سلول هاي عصبي، آندوتليال عروق، سلول هاي كبدي، ماكروفاژها، فيبروبلاست‌ها، ميوكارد و نيز تروفوبلاست‌هاي جفتي را در حيوانات آبستن مورد تهاجم قرار مي‌دهند. همچنين مرحله تاكي زوئيت‌ ممكن است از طريق جفت در حيوانات آبستن به جنين منتقل شود

 (Dubey and Lindsay 1993  et al. 2006; Dubey Barr et al. 1993;  ).

سيستم ايمني ميزبان مدتي پس از آلوده شدن ميزبان واسط بر عليه تاكي زوئيت‌ها كه داراي رشد و تكثير سريع هستند، تحريك و باعث حذف آنها از بافت‌ها مي شود. اين مرحله توسط برادي زوئيت‌هاي 8-7×2 ميكروني كه داراي رشد كندي بوده و در داخل سلول هاي ميزبان، درون كيست‌ها هستند، جايگزين مي‌شود. كيست‌هاي نئوسپورا كانينوم گرد تا بيضي شكل و بيشتر در سلول هاي عصبي و شبكيه چشم يافت مي‌شوند. اندازه کيست هاي بافتي ممکن است بسته به تعداد برادي زوئيت هاي داخل آن ها، بسيار متفاوت باشد. کيست هاي بافتي در سگ ها حدود 107 ميکرون قطر دارند و ضخامت ديواره آنها تا 4 ميکرون مي رسد.
کيست هاي بافتي در جنين گاو و گوساله هايي که به صورت مادرزادي مبتلا هستند در مغز و طناب نخاعي يافت مي شوند. اين کيست ها کمي بيش از 50 ميکرون قطر دارند و ضخامت ديواره آنها کمتر از 5/2 ميکرون است. تعداد کمي از کيست هاي بافتي با ديواره نازک (1- 3/0 ميکرون) در عضلات اسکلتي گاو و سگ هايي که به صورت طبيعي با انگلي شبيه نئوسپورا کانينوم آلوده بودند، گزارش شده است. چنين کيست هاي بافتي هنوز در حيواناتي که به صورت تجربي آلوده مي شوند ديده نشده است. برادي زوئيت‌ها درون كيست‌ها از پاسخ سيستم ايمني ميزبان در امان مي‌مانند و به حالت نهفته زندگي مي‌كنند، در نتيجه هيچ گونه واكنش ايمني ايجاد نمي‌كنند. زماني كه سيستم ايمني به هر علتي تضعيف شود دوباره به تاكي زوئيت تبديل مي‌شوند (et al. 2006 Dubey 2003b;  Dubey ).

برادي زوئيت ها واجد يک هسته انتهايي و تعداد کمي گرانول آميلوپکتين هستند كه در رنگ آميزي پريوديک اسيد شيف ,(PAS) رنگ قرمز مي گيرند. همچنين برادي زوئيت ها را مي توان به صورت اختصاصي توسط آنتي بادي اختصاصي برادي زوئيت (BAG-1) از تاکي زوئيت ها تفريق کرد. عمدتاً اعتقاد بر اين است که انگل به صورت مرحله برادي زوئيت (کيست هاي بافتي) در بافت هاي گاوهاي بالغ باقي مي ماند. با وجود اين، کيست هاي بافتي تا کنون در مقاطع بافت شناسي از گاوهاي بالغي که به صورت طبيعي مبتلا شده اند مشاهده نشده است (et al. 2006 Dubey).

تاكي زوئيت‌هاي موجود در جفت و كيست‌هاي موجود در بافت هاي ميزبان واسط منبع مهم آلودگي براي سگ‌ها هستند. سگ‌ها 7 تا 15 روز پس از خوردن بافت‌هاي آلوده ميزبان‌هاي واسط، اووسيست‌هاي انگل را با مدفوع خود دفع مي‌كنند (شكل 2-2). مدت زمان دفع اووسيست‌ها توسط سگ و تناوب آنها به درستي مشخص نيست، هر چند گزارش شده که سگ ها بيشتر از يک نوبت، اووسيست را دفع مي کنند (Mcgarry et al. 2003  2003 b;  Dubey).

 
شکل 1-2: سير تكاملي نئوسپورا کانينوم (19)

در رابطه با توان بقاي اووسيست‌ها در طبيعت نيز اطلاعات زيادي در دسترس نيست. مراحل شيزوگوني و گامتوگوني که به نظر مي رسد آغازگر تشکيل اووسيست ها در روده سگ هستند تا کنون مشاهده نشده اند. هر چند مراحلي شبيه شيزونت در کشت هاي سلولي کشت شده با برادي زوئيت هاي جدا شده از مغز سگ هايي که به صورت طبيعي مبتلا بودند، گزارش شده اند. مطالعات سرواپيدميولوژيک به اهميت نقش سگ ها در سير تكاملي نئوسپورا کانينوم اشاره دارد (et al. 2006 Dubey (.

تعداد صفحه :147

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

:        ****       info@elmyar.net

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  **** ***

جستجو در سایت : کلمه کلیدی خود را وارد نمایید :

 
 

مطالب مشابه را هم ببینید

 

فایل مورد نظر خودتان را پیدا نکردید ؟ نگران نباشید . این صفحه را نبندید ! سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های دانشگاهی است. مطالب مشابه را هم ببینید. برای یافتن فایل مورد نظر کافیست از قسمت جستجو استفاده کنید. یا از منوی بالای سایت رشته مورد نظر خود را انتخاب کنید و همه فایل های رشته خودتان را ببینید